qPCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法
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qPCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法
基因/样本
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一、血液
分离血清血浆应严格按照操作说明进行,操作需在1h内完成,避免出现溶血现象,血清血浆分离后避免反复冻融。(推荐抗凝剂:EDTA、柠檬酸钠)
血液样本RNA含量较低,所以需要通过加大样本量以富集足够多的RNA,以保证后续实验的顺利进行。
二、动物组织
1、有液氮的条件下
组织样本在离体后,快速用RNase-free配制的生理盐水或PBS清洗样本表面污渍,吸干表面液体后迅速将样本分割成约100mg(绿豆大小),约10小块左右,将样本放入已标记好名称且预冷好的RNase-free的EP管中(不要将盖子拧盖死,以免从液氮中取出时破裂),迅速投入液氮中速冻≥1h,然后取出置于-80℃保存,干冰运输。
组织离体后应在5min内用液氮浸没,让其迅速降温,彻底冷冻后转移至-80℃,避免反复冻融。
2、无液氮的条件下
提前准备好RNase-free的1.5mL的EP管,向其中加入1mL的RNAlater。组织样本离体后,快速用RNase-free生理盐水/PBS清洗样本表面的污渍,并吸干表面的液体,迅速的将样本分割后投入提前准备好的1.5mL的EP管中,使样本完全浸没在液体中,采样的容器应该足够大,避免组织块挤在一起,为避免组织块在运输的过程中露出液面,应将RNAlater灌满容器,将样本置于 4°C保存过夜(以使RNAlater完全渗透组织),然后转移至-80°C长期保存。
三、植物组织
1、选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位,植物组织越幼嫩越新鲜所含的次生代谢产物越少,随着植物的逐渐成熟,所含的次生代谢产物产量越来越多,而次生代谢产物会影响RNA的抽提,次生代谢产物越多,RNA抽提越困难,RNA的得率也越低。
2、组织块要切割成长宽高≤0.5cm的小块,考虑到可操作性,所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小。
3、迅速用预冷的RNase-free水配制的生理盐水或PBS清洗组织表面的污渍,吸干表面的液体处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-free的螺纹冻存管中,或用标记好名称的锡箔纸包裹好,液氮中迅速冷却1 h,转移到-80℃长期保存,在RNA提取前避免反复冻融。
四、细胞
1、把细胞及培养液一起收集到15mL,1500rpm离心3min,弃去上清;
2、加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;
3、弃去上清后于-80°C或者液氮冻存待用。
五、其它体液样本准备
1、收集5-10mL新鲜尿液、胆汁或者腹腔引流液,置于4°C或冰盒中正立放置之后转移离心管中;
2、4°C,1000rpm,离心10min,转移上清到新的离心管中,严格封口。- 80°C长期保存。
注意:
1、RNAlater保存的大块组织样本:组织块过大会影响RNAlater渗透入组织内部的效率,且RNAlater无法覆盖的组织部位极易被RNase降解,组织块需切成长宽高≤0.5cm的小块。
2、裂解液保存组织样本:除用trizol保存的细胞样本外,裂解液保存的组织样本(无论何种形式),抽提的RNA质量普遍很差。
3、锡箔纸包裹动物及临床组织样本:低温下锡箔纸与动物及临床组织样本会粘黏在一起,抽提RNA过程中容易带入,引起污染。
4、植物组织样本采用RNAlater保存:植物组织含有细胞壁及次生壁,RNAlater不易渗透入组织内部;同理,勿用trizol直接浸泡植物组织。
5、将植物组织磨成粉末寄送:植物组织在研磨成粉末后与外部接触面积大,反复冻融极易造成样本降解(尽量寄送绿豆大小的组织块)。
6、寄送充分裂解后的细胞:细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞,破碎的细胞会释放内源性RNase,从而降解RNA。
7、采用肝素作为抗凝剂:肝素是PCR酶的活性抑制剂,会抑制下游实验的PCR反应。(推荐采用EDTA或柠檬酸钠) 。
8、临床样本无法及时处理,直接寄送大块体积的组织
提取过程中会对大块样本组织进行分样处理,该过程极易引起组织降解(建议分装成小量多份)。
温馨提示:
1、向中科赛恩斯(以下简称“我司”)寄送样本或试剂等请先与项目专员进行沟通,约定好时间后再进行寄送。
2、未沟通或未经项目专员同意寄送的样本,出现任何问题,我司均不承担责任。
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4、在无特殊情况下,我司不接收邮费到付的样本。